昨天想做个实验差俩引物，老听人说primer5好用，寻思试试网页版。结果一打开满屏英文差点劝退，硬着头皮折腾半小时终于搞明白了，这就把踩坑过程掰开揉碎说说。

零基础硬闯官网

直接搜名字跳进官网首页，嚯！密密麻麻全是小字儿。眼睛扫了三遍才在左上角找到“Start Primer5 Web”这个按钮。点进去瞬间弹窗让选试用版（30天免费）还是学术版，咱这种临时工果断选试用。

手把手输入基因位置

新建任务时弹出一张大表格，第一行“Sequence”框最要紧。把之前在Genebank（记住编号比如NM_xxxxxx）复制好的序列整段粘贴进去。下面有个“Product Size”（产物长度）必须填，我填了个200到300。

重点来了：当时没注意右边“Exon/Intron Selection”（外显子选项），结果默认勾了跨外显子设计。后来发现引物位置卡在基因中间不对头，又倒回去取消勾选重做...

跟参数斗智斗勇

点开“Parameters”标签页直接傻眼：

• TM值默认60℃（咱做鱼的基因根本用不着这么高）
• GC含量范围40%-60%（毛霉菌的基因直接跌破下限）

赶紧抄起手机查实验室前辈的笔记，把TM值改成50℃，GC范围放宽到30%-70%。

最坑的是“Secondary Structures”（二级结构）默认不检查！得手动把“Hairpin”（发夹结构）和“Dimer”（二聚体）都勾上，阈值调低到2.0才放心。

结果翻车现场

激动地点完“Design Primers”，唰跳出十几对结果。随手挑了第一对准备下单，被师姐一巴掌拍醒：“这引物TM值差8℃你也敢用？” 原来排序默认按位置不按匹配度，得手动点“TM Difference”（TM值差异）标题栏排序，选了两个TM值只差1℃的。

接着发现右边序列显示框里，“GG”连在一起的字母变成红色警告——点开才发现有连续3个G会形成超稳定结构。只好挨个检查每条引物，看到标红的就点“X”删掉。

临门一脚查错配

好不容易筛出三对靠谱的，突然想起导师说要用“BLAST”查特异性（怕扩出别的基因）。在结果页面找了半天，终于发现序列框右下角藏着个小放大镜图标，点进去粘贴引物序列，勾上“Show similar sequences”（显示相似序列）等它跑完。

真踩雷了：有条引物和某个未知基因相似度80%！赶紧回头把“Specificity Check”（特异性检查）参数调严，重新生成后才安心导出序列。

血泪总结贴士

导出时才发现：

• 免费版只能导文本格式，想导出PDF得花钱
• 浏览器开久了会闪退，记得隔十分钟点保存
• 页面所有蓝色小问号都点开看看，藏着关键说明

折腾两小时终于搞定，比桌面版确实方便点，但没视频教程根本玩不转。建议新手直接把参数对照表贴屏幕上，省的来回翻车！