今天实验室的小师妹跑来问我怎么设计kasp引物，说看了半天论文还是蒙圈。我直接拍胸脯：这玩意儿有现成工具！当场就给她演示了一波，顺便把操作步骤全记下来。

准备工作

先打开电脑搜索框，敲了个关键词"kasp在线设计"。跳出来好几个链接，挑了个看起来最顺眼的网站点进去。甭管啥界面，先找"创建新项目"这种按钮就对了。

粘贴序列

从抽屉里翻出上周测序拿到的基因片段文档，选中那段长得要命的ATCG字母串。特别注意把上下游各500bp也复制进去，这步要是偷懒后面准出错。在网站上找到白底大文本框，"啪"地按ctrl+v黏贴。

• 关键设置1：在变异位点框里填上突变位置，我直接填了测序报告里的"chr3:125487"
• 关键设置2：引物长度调到22-25，Tm值设置成±2℃浮动

调整参数

看到高级选项就手痒点开，把二聚体检测和特异性检查都给勾上。右边还有个滑动条调GC含量，拉到40%-60%之间最保险。

页面最底下有个"避开连续G"的选项特逗，有次没勾选结果引物全是GGGGGG，气得师弟直骂街。

生成结果

戳完"开始设计"就翘着二郎腿等。比泡方便面还快，三十秒不到跳出三组引物方案。网站挺贴心，每套方案都给标了星级评分。挑了评分最高的那组，把FAM和HEX荧光标记那段复制下来发给师妹。

顺手点了右上角"导出表格"，把设计参数全存到U盘里。等下批样本到了直接调参数复用，省得重新折腾。

师妹捧着打印结果蹦蹦跳跳走了，全程也就十来分钟。下次谁再说引物设计难，直接把这教程甩他脸上！